Elektroforez moleküler biyolojide en çok kullanılan araçlardan biridir. Nükleik asidi ayırmak için kullanılır. Elektroporasyon, nükleik asidin boyutuna göre ayrılması işlemidir. Elektroforezde bir jel kullanılır. Nükleik asit numunelerinin yüklendiği jelde kuyucuklar yapılır. Elektrik akımı geçirilir ve nükleik asidin jel içinde hareket ettiği boyuta bağlı olarak. Nükleik asidi nicelleştirmeye, ayırmaya ve saflaştırmaya yardımcı olur.
Agaroz ve Poliakrilamid
Agaroz ve poliakrilamid arasındaki fark, agarozun büyük DNA parçalarını ayırmak için kullanılması, ancak daha kısa protein ve nükleik asit parçalarını ayırmak için poliakrilamid jel kullanılmasıdır. Agaroz yatay olarak, poliakrilamid ise dikey olarak dökülür. Agaroz yatay olarak ısıtılabilir ve dökülebilir ancak kolayca kırılır, bu nedenle dikkatli kullanılmalıdır.
Agaroz jel, en yaygın olarak elektroforezi çalıştırmak için kullanılır. Nükleik asitlerin boyutuna göre ayrılmasına yardımcı olduğu için bilinmeyen DNA veya RNA örneğini tanımlamak için kullanılır. Burada, bilinen boyutta bir merdiven kullanılır ve bilinmeyen nükleik bant, merdiven ile karşılaştırılır ve boyut belirlenir.
Poliakrilamid jel elektroforezi PAGE olarak adlandırılır. Proteinleri boyutlarına göre ayırmak için yaygın olarak kullanılır. Bu elektroforez, bir elektrik alanı sağlandığında yüklü protein veya nükleik asit numunesinin jel boyunca hareket etmesi ilkesine dayalı olarak çalışır. Biyolojik bir molekülün hareketliliği, boyut ve yüke bağlı olarak değiştiğinden. Kullanılan numune, hareketliliğin temelde boyuta bağlı olması için tek tip bir yüke ulaşacak şekilde işlenmelidir.
Agaroz ve Poliakrilamid Arasındaki Karşılaştırma Tablosu
| Karşılaştırma Parametreleri | agaroz | poliakrilamid |
| toksisite | toksik değil | biraz toksik |
| Gözenek büyüklüğü | Daha büyük gözenekler | Daha küçük gözenekler |
| kullanır | Agaroz jel çoğunlukla DNA ve RNA'yı ayırmak için kullanılır. | Poliakrilamid jel, proteini ayırmak ve miktarını belirlemek için kullanılır. |
| Jel dökme pozisyonu | Yatay pozisyon | Dikey pozisyon |
| Boya | etidyum bromür | bromofenol mavisi |
| yeniden kullanma | Agaroz eritilebilir ve yeniden kullanılabilir | Normalde yeniden kullanılmaz |
Agaroz nedir?
Agaroz, gözenekleri ve kanalları olan üç boyutlu bir matris olan bir jel oluşturmak için kullanılan bir biyomoleküldür. Üç boyutlu matris, hidrojen bağları ile bir arada tutulur. Hidrojen bağları olduğu için matris yapısı ısıtılarak kolayca denatüre edilebilir. Örnek biyomoleküller gözeneklerden geçer.
Agarın erime sıcaklığı 85-95 santigrat derece ve jelleşme sıcaklığı 35-42 santigrat derecedir. Agaroz jel, agarozun suyla karıştırılıp eritilmesiyle yapılır. Daha sonra tarağın yerleştirildiği bir kalıba yatay olarak dökülür. Agaroz daha sonra soğur ve bir jel oluşturur. Tarak, numunenin yüklenebileceği bir kuyu bırakır.
Düşük konsantrasyonlu agaroz jeli kırılmaya eğilimlidir. Bu nedenle, dikkatle ele alınmalıdır. Agaroz, DNA ve RNA'yı ayırmak için kullanılabilir. Agaroz jeldeki gözenekler, bakteriyofajın girmesi için çok daha büyüktür. Agaroz, piruvat ve sülfat grupları içeren bir polimerdir. Bu gruplar negatif yüklü olduğu için suyun DNA'nın hareket yönünün tersine akmasına neden olur.
Boya etidyum bromür, numunenin boyutunu ve yükünü değiştiren DNA'yı boyamak için kullanılır. Kuruluma bir tampon solüsyonu dökülür ve numunenin agaroz jeli boyunca hareket etmesine ve bantlar oluşturmasına neden olan akım geçirilir.
Poliakrilamid nedir?
Poliakrilamid, akrilamid ve akrilik asitten oluşan sentetik doğrusal bir polimerdir. Poliakrilamid, suyu aktif olarak emer ve yumuşak bir jel oluşturur. Elektroforezde kullanılan jellerden biridir. Protein ve nükleik asit, elektroforetik hareketliliklerine dayalı olarak poliakrilamid jelde ölçülebilir.
Akrilamid hidrasyonu ile yapılan poliakrilamid jel, hidrasyona bağlı olarak gözenek boyutu düzenlenebildiğinden iyidir. Küçük gözenek boyutuna sahip jel, daha küçük boyutlu moleküllerin incelenmesinde etkilidir. Daha büyük moleküller küçük gözeneklerden geçemez ve sıkışıp kalamazken, küçük moleküller kolayca gözeneklerden geçerek bantlar oluşturur.
Poliakrilamid jel, çoğunlukla SDS PAGE deneyinde kullanılan ünlüdür. SDS PAGE, Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi olarak genişler. Protein örneklerini boyutlarına göre ayırmak için kullanılır. Sodyum dodesil sülfat bir deterjandır ve protein molekülüne bağlanır. Proteine bağlandığında, bu deterjan proteinin ikincil ve üçüncül yapısını bozar ve onu doğrusal bir polipeptit zinciri haline getirir. Bu lineer polipeptid negatif yüklüdür ve bir elektrik alanına maruz kaldığında anoda doğru hareket eder. Burada molekülün kat ettiği mesafe, moleküler ağırlığın logaritması ile ters orantılıdır. Düşük moleküler ağırlıklı nükleik asit numunelerini incelemek için de kullanılır.
Agaroz ve Poliakrilamid Arasındaki Temel Farklar
Çözüm
Agaroz ve poliakrilamid iki farklı polimerdir. Kimyasal olarak farklıdırlar. Her ikisi de elektroforez için kullanılsa da iki farklı amaç için kullanılırlar. Agaroz daha büyük gözeneklere sahiptir ve DNA ve RNA gibi daha büyük Nükleik asit moleküllerini ayırmak için kullanılır. Poliakrilamid ise daha küçük gözeneklere sahiptir ve daha küçük moleküler ağırlıklı proteinleri ayırmak ve ölçmek için kullanılır.
Bu bileşiklerin her ikisi de farklı amaçlara hizmet eder ve moleküler biyolojide çok faydalıdır. Moleküler biyolojinin yanı sıra birçok başka alanda da kullanılmaktadırlar. Bu jeller, nükleik asit ve proteinin miktarını belirlemeye yardımcı olduğundan tıp ve adli bilimlerde uygulamaları vardır.
